高效液相色谱法测定盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂的含量及有关物质
作者：王卫
单位：王卫(天津市药品检验所 天津 300070)
关键词：高效液相色谱法；盐酸维拉帕米；有关物质
药物分析杂志000215 摘要 目的：建立一种用高效液相色谱法测定盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂的含量及有关物质的方法。方法：以ODS为固定相。醋酸盐缓冲溶液-甲醇-三乙胺(55∶45∶1)为流动相，检测波长为278 nm。结果：盐酸维拉帕米的浓度在0.05～1.0 mg.mL-1范围内线性关系良好，回归方程：Y=1.08×103+3.013×105X，r=0.999 9。精密度试验RSD=0.2%(n=10)，最低检出限为0.1 μg.mL-1(S/N=3)。片剂、注射剂回收率(n=6)分别为99.5%(RSD=0.4%)；101.1%(RSD=0.2%)。有关物质可检出4个杂质。结论：本方法简单、快速、结果准确。
, 百拇医药
Assay and Tests for Related Substances of Verapamil Hydrochloride,Its Tablet and Injection by HPLC
Wang Wei
(Tianjin Institute of Drug Control,Tianjin 300070)
Abstract Objective：A HPLC method was established for the determination of verapamil hydrochloride,its tablet,injection and related compounds.Method:Verapamil hydrochloride was separated on an ODS column with the mobile phase of acetate buffer-methanol-triethylamine(55∶45∶1) and detected at 278 nm.Results:The standard curve was linear in the range of 0.05～1.0 mg.mL-1 and the correlation coefficient was 0.999 9.The precision of verapamil hydrochloride was good(RSD=0.2%，n=10)and the average recovery of the tablet was 99.5%(RSD=0.4%，n=6)and that of the injection was 101.1%(RSD=0.2%，n=6).Conclusion:The proposed method is simple,rapid,accurate and reliable.
, 百拇医药
Key words HPLC,verapamil hydrochloride,related compounds
盐酸维拉帕米(异搏定，C27H38N2O4。HCl)为罂粟碱的衍生物。是钙离子拮抗剂，并为抑制β-受体的冠状动脉扩张剂。其原料、片剂和注射剂，在中国药典1995年版、USPⅩ Ⅹ Ⅲ版、BP 1993版及日本药局方第十三改正版中均有收载。含量测定方法有非水滴定法[1～4]、紫外分光光度法[1,2]及高效液相色谱法[4]；有关物质检查方法有薄层色谱法[1～3]及高效液相色谱法[4]。
中国药典1995年版采用非水滴定法测定盐酸维拉帕米的含量，紫外双波长法测定其片剂的含量，紫外吸收系数法测定注射剂的含量，有关物质检查中是采用薄层色谱法控制1个杂质。为了使测定方法统一及消除相关杂质的干扰，作为2000年版药典工作，我们对1995年版中国药典中盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂的含量测定及有关物质检查进行了修订。现均采用高效液相色谱法测定，简单、快速、结果准确。
, 百拇医药
1 仪器、药品及试剂
日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10AV紫外检测器，CTO-10A柱温箱，C-R7A数据处理机。盐酸维拉帕米对照品由中国药品生物制品检定所提供(含量为99.9%)，其原料和制剂由有关药厂提供，甲醇、冰醋酸和醋酸钠均为分析纯。
2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 Irregular-H C18(4.6 mm×200 mm，10 μm)，柱温40 ℃。醋酸盐缓冲溶液的配制：精密称取醋酸钠1.36 g，加水适量，振摇使溶解，加冰醋酸33 mL，加水稀释至1 000 mL，摇匀(pH=4.0，无需调节)。以醋酸盐缓冲溶液-甲醇-三乙胺(55∶45∶1)为流动相，流速：1.0 mL。min-1，检测波长：278 nm，理论板数按盐酸维拉帕米计算应不低于2 000。
, 百拇医药
3 溶液的配制
3.1 对照品溶液 取盐酸维拉帕米对照品适量，精密称定，加流动相使溶解并定量稀释成0.25 mg。mL-1的溶液。
3.2 原料供试品溶液 取盐酸维拉帕米原料，照“3.1”项操作，即得。
3.3 片剂供试品溶液 取本品20片除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于盐酸维拉帕米125 mg)，置50 mL量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
3.4 注射剂供试品溶液 精密量取本品适量(约相当于盐酸维拉帕米12.5 mg)，置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
4 标准曲线的制备
, 百拇医药
4.1 含量测定标准曲线 取盐酸维拉帕米对照品适量，精密称定，加流动相使溶解并定量稀释成1.25 mg。mL-1的溶液。分别精密量取1，2，5，8，10，20 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以盐酸维拉帕米的峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，进行线性回归。结果表明，盐酸维拉帕米浓度在0.05～1.0 mg。mL-1范围内，线性关系良好。回归方程(n=6)：
Y＝1.08×103+3.013×105X r=0.999 9
盐酸维拉帕米的检出限为0.1 μg。mL-1(S/N=3)。
4.2 有关物质检查标准曲线 取盐酸维拉帕米对照品适量，精密称定，加流动相使溶解并定量稀释成0.05 mg。mL-1的溶液，分别精密量取0.5，1，2，5，12.5 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。按“4.1”项同法操作，结果表明，盐酸维拉帕米浓度在0.001～0.05 mg。mL-1范围内，线性关系良好。回归方程(n=6)：
, 百拇医药
Y=3.173×105X+60.6 r=0.999 9
自身对照溶液的浓度为12.5 μg。mL-1(1.0%。)
5 重现性和稳定性试验
取对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，重复进样10次，以色谱峰面积计算，RSD=0.2%。对照品溶液及供试品溶液在室温保存24 h后测定，结果基本不变。
6 回收率试验
6.1 片剂 分别称取处方量辅料，精密加入盐酸维拉帕米对照品适量(约125 mg)，混匀。照“3.3”项下制备溶液，分别精密量取此液及对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，求得平均回收率为99.5%， RSD=0.4%(n=6)。辅料对测定均无干扰。
, 百拇医药
6.2 注射剂 分别取盐酸维拉帕米适量，精密称定，加按处方配制的注射用水使溶解，并稀释制成0.25 mg。mL-1的溶液，照“6.1”项下方法测定，得平均回收率为101.1%，RSD=0.2%(n=6)，溶剂对测定无干扰。
7 盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂含量测定
分别精密量取各供试品溶液及对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图(图1-A)，按外标法以峰面积计算，即得。本法与中国药典法测得结果见表1。
图1 盐酸维拉帕米含量测定(A)及有关物质检查(B)的色谱图
1.杂质1 2.杂质2 3.杂质3 4.杂质4 5.盐酸维拉帕米
, 百拇医药
8 盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂有关物质测定
8.1 盐酸维拉帕米 取盐酸维拉帕米，精密称定，加流动相制成2.5 mg。mL-1的溶液，作为供试品溶液；量取适量，加流动相制成25.0 μg。mL-1的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10%；再取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的3倍。
8.2 片剂 取“3.3”项下的续滤液作为供试品溶液。照“8.1”项下的方法测定。
8.3 注射剂 取本品作为供试品溶液。照“8.1”项下的方法测定。供试品溶液色谱图中第1个倒峰为溶剂峰(见图3-B)。
8.4 测定结果 本法与中国药典法测得结果见表1。我们对HPLC及药典方法的含量测定结果进行了配对t检验，结果表明：t=1.9521-0.05/2=2.262 ，故2方法测定结果无显著性差异。
, 百拇医药
表1 2种方法测定结果比较(%，n=2) 批号
产地
剂型
含量
有关物质*
本法
药典法
本法
药典法
810804
天津
原料
100.1
, http://www.100md.com
99.3
0.21(4)
<0.5(1)
910401
天津
原料
100.3
99.5
0.05(1)
<0.5(1)
971001
天津
原料
, 百拇医药
100.5
99.6
<0.04(1)
<0.5(1)
980302
天津
原料
100.0
99.7
<0.04(1)
<0.5(1)
960503
天津
, http://www.100md.com
片剂
98.3
97.1
0.04(1)
<0.5(1)
961203
天津
片剂
97.1
95.8
0.04(3)
<0.5(1)
970201
, 百拇医药
上海
片剂
98.1
97.7
0.07(2)
<0.5(1)
980304
上海
片剂
100.5
98.9
0.05(1)
<0.5(1)
, 百拇医药
910802
上海
注射剂
100.5
99.2
0.04(1)
<0.5(1)
970201
上海
注射剂
101.1
102.2
0.05(1)
, http://www.100md.com
<0.5(1)
*括号内为杂质个数9 讨论
9.1 波长的选择 用流动相溶解样品，在紫外200～400 nm之间测定吸收度。在278和234 nm波长处有最大吸收，为避免紫外末端吸收的影响，我们选择278 nm作为测定波长。
9.2 流动相的选择 USPⅩ Ⅹ Ⅲ版中盐酸维拉帕米含量测定的流动相为醋酸盐缓冲溶液-乙腈-正庚胺(55∶45∶0.5)。正庚胺很难买到，经分析加入其目的是使色谱峰形得到改善，遂选用三乙胺代替。经考察溶液pH对分离效果的影响(图2)，调整三乙胺的比例，可以使4个杂质峰与主峰得到良好分离，得到了满意的结果(图1-B)。使用甲醇代替乙腈降低了试验成本。
图2 不同pH的流动相对盐酸维拉帕米
, 百拇医药
及其有关杂质保留时间的影响
1.杂质1 2.杂质2 3.杂质3 4.杂质4 5.盐酸维拉帕米
9.3 有关物质考察(破坏性试验) 取盐酸维拉帕米供试品溶液及盐酸维拉帕米注射剂，暴露于日光下10 d后，依法测定，其有关物质均有很大增加(图3-A，B)，说明本方法可有效地检出盐酸维拉帕米的降解产物。
图3 盐酸维拉帕米原料的供试品溶液(A)及注射液(B)
暴露于日光下10 d的色谱图
1.均为杂质 2.盐酸维拉帕米
9.4 有关物质检查 中国药典为薄层色谱法，只控制1个杂质的限量；本文采用HPLC自身对照法来控制相关杂质的含量，其色谱条件与含量测定相同，在含量测定的同时，即可测得有关物质的结果。所使用的色谱系统，可以保证盐酸维拉帕米与4个相关杂质得到良好的基线分离，测定结果也更加精确。
参考文献
1，中国药典.1995.二部：696
2，BP.1993.700，1146
3，JP.Ⅹ Ⅲ.1996.704
4，USP.Ⅹ Ⅹ Ⅲ.1995.1624
(本文于1999年2月25日收到), http://www.100md.com
单位：王卫(天津市药品检验所 天津 300070)
关键词：高效液相色谱法；盐酸维拉帕米；有关物质
药物分析杂志000215 摘要 目的：建立一种用高效液相色谱法测定盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂的含量及有关物质的方法。方法：以ODS为固定相。醋酸盐缓冲溶液-甲醇-三乙胺(55∶45∶1)为流动相，检测波长为278 nm。结果：盐酸维拉帕米的浓度在0.05～1.0 mg.mL-1范围内线性关系良好，回归方程：Y=1.08×103+3.013×105X，r=0.999 9。精密度试验RSD=0.2%(n=10)，最低检出限为0.1 μg.mL-1(S/N=3)。片剂、注射剂回收率(n=6)分别为99.5%(RSD=0.4%)；101.1%(RSD=0.2%)。有关物质可检出4个杂质。结论：本方法简单、快速、结果准确。
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Assay and Tests for Related Substances of Verapamil Hydrochloride,Its Tablet and Injection by HPLC
Wang Wei
(Tianjin Institute of Drug Control,Tianjin 300070)
Abstract Objective：A HPLC method was established for the determination of verapamil hydrochloride,its tablet,injection and related compounds.Method:Verapamil hydrochloride was separated on an ODS column with the mobile phase of acetate buffer-methanol-triethylamine(55∶45∶1) and detected at 278 nm.Results:The standard curve was linear in the range of 0.05～1.0 mg.mL-1 and the correlation coefficient was 0.999 9.The precision of verapamil hydrochloride was good(RSD=0.2%，n=10)and the average recovery of the tablet was 99.5%(RSD=0.4%，n=6)and that of the injection was 101.1%(RSD=0.2%，n=6).Conclusion:The proposed method is simple,rapid,accurate and reliable.
, 百拇医药
Key words HPLC,verapamil hydrochloride,related compounds
盐酸维拉帕米(异搏定，C27H38N2O4。HCl)为罂粟碱的衍生物。是钙离子拮抗剂，并为抑制β-受体的冠状动脉扩张剂。其原料、片剂和注射剂，在中国药典1995年版、USPⅩ Ⅹ Ⅲ版、BP 1993版及日本药局方第十三改正版中均有收载。含量测定方法有非水滴定法[1～4]、紫外分光光度法[1,2]及高效液相色谱法[4]；有关物质检查方法有薄层色谱法[1～3]及高效液相色谱法[4]。
中国药典1995年版采用非水滴定法测定盐酸维拉帕米的含量，紫外双波长法测定其片剂的含量，紫外吸收系数法测定注射剂的含量，有关物质检查中是采用薄层色谱法控制1个杂质。为了使测定方法统一及消除相关杂质的干扰，作为2000年版药典工作，我们对1995年版中国药典中盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂的含量测定及有关物质检查进行了修订。现均采用高效液相色谱法测定，简单、快速、结果准确。
, 百拇医药
1 仪器、药品及试剂
日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10AV紫外检测器，CTO-10A柱温箱，C-R7A数据处理机。盐酸维拉帕米对照品由中国药品生物制品检定所提供(含量为99.9%)，其原料和制剂由有关药厂提供，甲醇、冰醋酸和醋酸钠均为分析纯。
2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 Irregular-H C18(4.6 mm×200 mm，10 μm)，柱温40 ℃。醋酸盐缓冲溶液的配制：精密称取醋酸钠1.36 g，加水适量，振摇使溶解，加冰醋酸33 mL，加水稀释至1 000 mL，摇匀(pH=4.0，无需调节)。以醋酸盐缓冲溶液-甲醇-三乙胺(55∶45∶1)为流动相，流速：1.0 mL。min-1，检测波长：278 nm，理论板数按盐酸维拉帕米计算应不低于2 000。
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3 溶液的配制
3.1 对照品溶液 取盐酸维拉帕米对照品适量，精密称定，加流动相使溶解并定量稀释成0.25 mg。mL-1的溶液。
3.2 原料供试品溶液 取盐酸维拉帕米原料，照“3.1”项操作，即得。
3.3 片剂供试品溶液 取本品20片除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于盐酸维拉帕米125 mg)，置50 mL量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
3.4 注射剂供试品溶液 精密量取本品适量(约相当于盐酸维拉帕米12.5 mg)，置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
4 标准曲线的制备
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4.1 含量测定标准曲线 取盐酸维拉帕米对照品适量，精密称定，加流动相使溶解并定量稀释成1.25 mg。mL-1的溶液。分别精密量取1，2，5，8，10，20 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以盐酸维拉帕米的峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，进行线性回归。结果表明，盐酸维拉帕米浓度在0.05～1.0 mg。mL-1范围内，线性关系良好。回归方程(n=6)：
Y＝1.08×103+3.013×105X r=0.999 9
盐酸维拉帕米的检出限为0.1 μg。mL-1(S/N=3)。
4.2 有关物质检查标准曲线 取盐酸维拉帕米对照品适量，精密称定，加流动相使溶解并定量稀释成0.05 mg。mL-1的溶液，分别精密量取0.5，1，2，5，12.5 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。按“4.1”项同法操作，结果表明，盐酸维拉帕米浓度在0.001～0.05 mg。mL-1范围内，线性关系良好。回归方程(n=6)：
, 百拇医药
Y=3.173×105X+60.6 r=0.999 9
自身对照溶液的浓度为12.5 μg。mL-1(1.0%。)
5 重现性和稳定性试验
取对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，重复进样10次，以色谱峰面积计算，RSD=0.2%。对照品溶液及供试品溶液在室温保存24 h后测定，结果基本不变。
6 回收率试验
6.1 片剂 分别称取处方量辅料，精密加入盐酸维拉帕米对照品适量(约125 mg)，混匀。照“3.3”项下制备溶液，分别精密量取此液及对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，求得平均回收率为99.5%， RSD=0.4%(n=6)。辅料对测定均无干扰。
, 百拇医药
6.2 注射剂 分别取盐酸维拉帕米适量，精密称定，加按处方配制的注射用水使溶解，并稀释制成0.25 mg。mL-1的溶液，照“6.1”项下方法测定，得平均回收率为101.1%，RSD=0.2%(n=6)，溶剂对测定无干扰。
7 盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂含量测定
分别精密量取各供试品溶液及对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图(图1-A)，按外标法以峰面积计算，即得。本法与中国药典法测得结果见表1。
图1 盐酸维拉帕米含量测定(A)及有关物质检查(B)的色谱图
1.杂质1 2.杂质2 3.杂质3 4.杂质4 5.盐酸维拉帕米
, 百拇医药
8 盐酸维拉帕米及其片剂和注射剂有关物质测定
8.1 盐酸维拉帕米 取盐酸维拉帕米，精密称定，加流动相制成2.5 mg。mL-1的溶液，作为供试品溶液；量取适量，加流动相制成25.0 μg。mL-1的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10%；再取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的3倍。
8.2 片剂 取“3.3”项下的续滤液作为供试品溶液。照“8.1”项下的方法测定。
8.3 注射剂 取本品作为供试品溶液。照“8.1”项下的方法测定。供试品溶液色谱图中第1个倒峰为溶剂峰(见图3-B)。
8.4 测定结果 本法与中国药典法测得结果见表1。我们对HPLC及药典方法的含量测定结果进行了配对t检验，结果表明：t=1.952
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表1 2种方法测定结果比较(%，n=2) 批号
产地
剂型
含量
有关物质*
本法
药典法
本法
药典法
810804
天津
原料
100.1
, http://www.100md.com
99.3
0.21(4)
<0.5(1)
910401
天津
原料
100.3
99.5
0.05(1)
<0.5(1)
971001
天津
原料
, 百拇医药
100.5
99.6
<0.04(1)
<0.5(1)
980302
天津
原料
100.0
99.7
<0.04(1)
<0.5(1)
960503
天津
, http://www.100md.com
片剂
98.3
97.1
0.04(1)
<0.5(1)
961203
天津
片剂
97.1
95.8
0.04(3)
<0.5(1)
970201
, 百拇医药
上海
片剂
98.1
97.7
0.07(2)
<0.5(1)
980304
上海
片剂
100.5
98.9
0.05(1)
<0.5(1)
, 百拇医药
910802
上海
注射剂
100.5
99.2
0.04(1)
<0.5(1)
970201
上海
注射剂
101.1
102.2
0.05(1)
, http://www.100md.com
<0.5(1)
*括号内为杂质个数9 讨论
9.1 波长的选择 用流动相溶解样品，在紫外200～400 nm之间测定吸收度。在278和234 nm波长处有最大吸收，为避免紫外末端吸收的影响，我们选择278 nm作为测定波长。
9.2 流动相的选择 USPⅩ Ⅹ Ⅲ版中盐酸维拉帕米含量测定的流动相为醋酸盐缓冲溶液-乙腈-正庚胺(55∶45∶0.5)。正庚胺很难买到，经分析加入其目的是使色谱峰形得到改善，遂选用三乙胺代替。经考察溶液pH对分离效果的影响(图2)，调整三乙胺的比例，可以使4个杂质峰与主峰得到良好分离，得到了满意的结果(图1-B)。使用甲醇代替乙腈降低了试验成本。
图2 不同pH的流动相对盐酸维拉帕米
, 百拇医药
及其有关杂质保留时间的影响
1.杂质1 2.杂质2 3.杂质3 4.杂质4 5.盐酸维拉帕米
9.3 有关物质考察(破坏性试验) 取盐酸维拉帕米供试品溶液及盐酸维拉帕米注射剂，暴露于日光下10 d后，依法测定，其有关物质均有很大增加(图3-A，B)，说明本方法可有效地检出盐酸维拉帕米的降解产物。
图3 盐酸维拉帕米原料的供试品溶液(A)及注射液(B)
暴露于日光下10 d的色谱图
1.均为杂质 2.盐酸维拉帕米
9.4 有关物质检查 中国药典为薄层色谱法，只控制1个杂质的限量；本文采用HPLC自身对照法来控制相关杂质的含量，其色谱条件与含量测定相同，在含量测定的同时，即可测得有关物质的结果。所使用的色谱系统，可以保证盐酸维拉帕米与4个相关杂质得到良好的基线分离，测定结果也更加精确。
参考文献
1，中国药典.1995.二部：696
2，BP.1993.700，1146
3，JP.Ⅹ Ⅲ.1996.704
4，USP.Ⅹ Ⅹ Ⅲ.1995.1624
(本文于1999年2月25日收到), http://www.100md.com